沙眼衣原體( Chlamydia trachomatis，Ct）是目前常見(jiàn)的生殖道感染性病原體之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)計(jì)，每年新增Ct感染人數(shù)達(dá)1.3億。Ct感染后有50-70%的患者無(wú)明顯臨床癥狀，女性則70-80%。然而，無(wú)論癥狀性感染和無(wú)癥狀感染均會(huì)導(dǎo)致后遺癥，主要影響女性生殖系統(tǒng)，可能出現(xiàn)盆腔炎、異位妊娠和輸卵管不孕。此外，Ct與人乳頭瘤病毒和HIV的感染有關(guān)。由于Ct目前仍缺乏有效疫苗，對(duì)Ct的防治主要依賴于早期篩查、早診斷和早治療，選擇高效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷方法對(duì)控制Ct感染具有重要的影響。

　　中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病控制中心于2007年制定了第一版《生殖道沙眼衣原體感染診斷指南》，2020年中心根據(jù)世界衛(wèi)生組織指南和最新的研究結(jié)果對(duì)該指南進(jìn)行了修訂，新版指南將核酸檢測(cè)作為生殖道沙眼衣原體感染檢測(cè)的主要方法。

　　沙眼衣原體實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段：第一階段是沙眼衣原體細(xì)胞培養(yǎng)，即通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)證明衣原體包涵體的存在；第二階段是非培養(yǎng)階段，相繼建立了酶免疫方法（EIA）、直接免疫熒光法（DFA）和免疫層析法（ICT），直接檢測(cè)樣本中的沙眼衣原體抗原；第三階段是核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAATs）階段，如熒光PCR、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。下文則逐個(gè)展開(kāi)簡(jiǎn)要介紹。

　　各樣本采集方式

1. 　　尿液采集：采集清晨首次尿液或至少禁尿1h后的尿液，用無(wú)菌、無(wú)防腐劑的塑料器皿收集10-20mL前段尿液。
2. 　　尿道拭子：男性取材前1h內(nèi)不排尿，采用男性拭子插入尿道內(nèi)2-3cm，以旋轉(zhuǎn)方式輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)并保留5-10s后取出。女性可用手指自恥骨聯(lián)合后沿女性尿道走向輕輕按摩尿道，用同男性相似的方法取材。
3. 　　宮頸拭子：采樣時(shí)先用生理鹽水濕潤(rùn)的擴(kuò)陰器擴(kuò)陰，無(wú)菌棉拭子清除宮頸口外面的分泌物，再將女性取材拭子插入宮頸管內(nèi)1-2cm，稍用力轉(zhuǎn)動(dòng)，保留5-10s后取出。細(xì)胞刷采樣：無(wú)菌棉拭子清潔宮頸口外表面，然后將細(xì)胞刷插入宮頸管內(nèi)1-1.5cm，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈，停留數(shù)秒后取出。孕婦不應(yīng)選擇細(xì)胞刷采樣方法。
4. 　　肛拭子：將取材拭子插入肛管2-3cm，接觸側(cè)壁10s，從緊靠肛環(huán)邊的隱窩中采集分泌物。被糞便嚴(yán)重污染的拭子必須丟棄，更換拭子后重新取材。
5. 　　口咽拭子：用壓舌板固定舌頭，拭子越過(guò)舌根到咽后壁及扁桃體隱窩、側(cè)壁等處，反復(fù)擦拭3-5次采集分泌物。
6. 　　陰道拭子：對(duì)青春期前女孩，將取材拭子放置于陰道后穹窿10-15s，采集陰道分泌物。對(duì)于處女膜完整的幼女需采用男性拭子，可通過(guò)處女膜孔采集陰道樣本。
7. 　　常規(guī)陰道拭子采集可用溫鹽水濕潤(rùn)陰道窺器，輕輕按壓子宮，打開(kāi)窺器，使用試劑盒推薦的采樣拭子放置于陰道后穹窿10-15s，采集陰道分泌物。
8. 　　眼結(jié)膜拭子：翻開(kāi)下眼瞼，從眼角向中間輕輕用拭子擦拭下眼結(jié)膜表面采集分泌物。

　　細(xì)胞培養(yǎng)

　　一、檢測(cè)原理：

　　沙眼衣原體自身不能產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP），需依賴于宿主細(xì)胞提供。某些腫瘤細(xì)胞系可作為沙眼衣原體的易感細(xì)胞，經(jīng)化學(xué)物質(zhì)處理和離心使衣原體吸附于易感細(xì)胞。在適宜的培養(yǎng)條件下，沙眼衣原體以EB（原體）的形式侵入宿主細(xì)胞，被細(xì)胞膜包裹形成包涵體。內(nèi)化的EB（始體）分化成代謝活躍、體積較大且有分裂能力的RB,RB以二分裂的方式增殖并發(fā)育為成熟的子代EB，包涵體逐漸脹大，48-72h后包涵體和宿主細(xì)胞破裂釋放出成熟的EB，再重新感染易感細(xì)胞。培養(yǎng)物經(jīng)染色后于顯微鏡下可見(jiàn)包涵體。

　　二、檢測(cè)準(zhǔn)備：

• 　　儀器設(shè)備：C02培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、低溫冰箱或液氮罐、離心機(jī)及水浴鍋等。
• 　　細(xì)胞株：常用的敏感細(xì)胞株有McCoy、HeLa229或BHK-21細(xì)胞等。
• 　　檢測(cè)試劑：胰酶-EDTA液、樣本運(yùn)輸培養(yǎng)基、衣原體生長(zhǎng)培養(yǎng)基、衣原體分離培養(yǎng)基、碘染色液、姬姆薩染色液及衣原體熒光單克隆抗體試劑等。

　　三、樣本采集：

　　細(xì)胞培養(yǎng)支持多種樣本類(lèi)型，包括男性尿道樣本、女性宮頸樣本、直腸樣本、口咽樣本、眼結(jié)膜等樣本。此外細(xì)胞培養(yǎng)還可利用鼻咽位樣本。采集樣本洗脫于運(yùn)送培養(yǎng)基中保存在普通冰箱（2-8℃）內(nèi)，24h內(nèi)接種，超過(guò)24h應(yīng)放置于低溫冰箱（-20℃）保存。

　　四、檢測(cè)流程：

　　1. 細(xì)胞復(fù)蘇

　　將凍存的細(xì)胞管放置于37℃水浴中速溶（1min內(nèi)），將已復(fù)溫融化的細(xì)胞全部轉(zhuǎn)移至已含有10 mL RPMI1640培養(yǎng)液的15mL離心管中，1000×g，離心5min，棄去上清液，加入適量培養(yǎng)液混勻后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1×106/mL左右，37℃，5%C02環(huán)境下培養(yǎng)過(guò)夜。次日更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基觀察生長(zhǎng)情況，及時(shí)傳代。

　　2. 單層細(xì)胞制備

　　根據(jù)試驗(yàn)的目的可以選用不同孔的培養(yǎng)板進(jìn)行試驗(yàn)，以下步驟以96孔培養(yǎng)板為例，其他孔培養(yǎng)板可參照表1的比例進(jìn)行調(diào)整。提前將已滅菌處理0.25cm的蓋玻片放入培養(yǎng)板孔內(nèi)，注意觀察蓋玻片是否平鋪于培養(yǎng)板孔中。加入適量的細(xì)胞及培養(yǎng)液，37℃、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)48h，鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及密度，待形成均勻覆蓋孔底的單層細(xì)胞。

　　3. 樣本接種與感染細(xì)胞

　　將保存于冰箱的樣本放置于37℃水浴中速融。在已接種細(xì)胞的培養(yǎng)板孔中加入適量樣本，每份樣本接種2孔。同時(shí)每板設(shè)有陽(yáng)性和陰性對(duì)照孔。將接種后的培養(yǎng)板放置于22-35℃、3000×g條件下離心1h。去除樣本液，每孔加衣原體分離培養(yǎng)基0.1mL，放置于37℃、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。試驗(yàn)孔處理：第1孔（放入的蓋玻片上）進(jìn)行碘染色、姬姆薩染色或熒光單抗染色。如第1孔陰性，則第2孔進(jìn)行盲傳，如為陽(yáng)性，則保存菌種。

　　4. 染色鑒定

　　沙眼衣原體培養(yǎng)后可以通過(guò)碘染色和姬姆薩染色進(jìn)行初步鑒定，通過(guò)直接免疫熒光法進(jìn)行確證。

• 　　碘染色：棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，每孔加入0.2mL甲醇，固定感染細(xì)胞10min，棄去甲醇后加碘染色液染5~10min。在玻片上滴加1μL碘甘油封片，取出蓋玻片，將細(xì)胞面朝下放在封固液上，顯微鏡下觀察結(jié)果。
• 　　姬姆薩染色：培養(yǎng)孔棄去培養(yǎng)液，每孔加入0.2mL甲醇，固定感染細(xì)胞10min，棄去甲醇后加姬姆薩染色液染30min，在玻片上滴加1μL碘甘油封片，取出蓋玻片，顯微鏡下觀察結(jié)果。
• 　　直接免疫熒光法：感染細(xì)胞用甲醇/丙酮固定10min，棄去甲醇后加熒光標(biāo)記單克隆抗體，37℃孵育30min，洗滌數(shù)次，取出蓋玻片放置于載玻片上，用堿性甘油封片后在熒光顯微鏡下檢查。

　　5. 結(jié)果判讀

　　沙眼衣原體培養(yǎng)陽(yáng)性時(shí)，碘染色鏡檢可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)深棕色包涵體;姬姆薩染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)紫紅色包涵體;熒光單抗染色可見(jiàn)蘋(píng)果綠色熒光的包涵體和原體顆粒。 圖片

　　五、結(jié)果報(bào)告：

• 　　可見(jiàn)沙眼衣原體生長(zhǎng)。
• 　　未見(jiàn)沙眼衣原體生長(zhǎng)。

　　六、臨床意義：

　　臨床樣本中見(jiàn)沙眼衣原體生長(zhǎng)可作為診斷生殖道沙眼衣原體感染的依據(jù)，但培養(yǎng)法靈敏度不高，因此臨床樣本未見(jiàn)沙眼衣原體生長(zhǎng)時(shí)不能排除患者有生殖道沙眼衣原體感染。

　　七、注意事項(xiàng)：

• 　　棉拭子含有對(duì)衣原體生長(zhǎng)有影響的物質(zhì)，取材后立即將樣本洗脫到運(yùn)輸培養(yǎng)基后，棄去拭子。
• 　　樣本取材后盡快接種，24h內(nèi)不能接種應(yīng)放置-70℃冰箱。
• 　　尿液、精液樣本及服過(guò)抗生素和使用陰道制劑的患者樣本不宜做衣原體培養(yǎng)。
• 　　單層細(xì)胞制備時(shí)如果細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密，包涵體染色過(guò)暗，側(cè)應(yīng)降低培養(yǎng)中的細(xì)胞濃度。
• 　　細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏、條束化，不能成片或被污染時(shí)，則應(yīng)重新復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞傳代次數(shù)超過(guò)5代不可進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。
• 　　胎牛血清質(zhì)量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響很大，應(yīng)選擇質(zhì)量合格的血清。
• 　　放線菌酮的濃度對(duì)于衣原體生長(zhǎng)影響較大，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況而定。

　　培養(yǎng)法曾經(jīng)被認(rèn)為是檢測(cè)沙眼衣原體感染的「金標(biāo)準(zhǔn)」方法。由于該法檢測(cè)敏感性較低（50-80%），且設(shè)備和操作技術(shù)要求高，樣本運(yùn)輸需低溫以保持沙眼衣原體的活性，試驗(yàn)周期長(zhǎng)（需3-5d），樣本要求高，僅在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，用于科學(xué)研究、抗菌藥物敏感性試驗(yàn)和方法學(xué)評(píng)價(jià)等。目前美國(guó)CDC在男童性侵和女童的生殖道外部感染的檢測(cè)中推薦使用該方法。

　　抗原檢測(cè)法

　　沙眼衣原體抗原檢測(cè)方法包括免疫層析法、直接免疫熒光法。

　　一、免疫層析法

　　1. 檢測(cè)原理：

　　樣本中衣原體脂多糖抗原與膠體金或乳膠標(biāo)記的衣原體單克隆抗體結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物通過(guò)毛細(xì)作用發(fā)生遷移，與固定有抗衣原體脂多糖的單克隆抗體結(jié)合顯色。

　　2. 檢測(cè)準(zhǔn)備：

　　相應(yīng)品牌的抗原檢測(cè)試劑盒。

　　3. 樣本采集：

　　該方法檢測(cè)的適宜樣本一般為宮頸樣本和尿道樣本。

　　4. 檢測(cè)流程：

　　按照相應(yīng)品牌的說(shuō)明書(shū)操作即可，一般15-30分鐘出結(jié)果。

　　5. 臨床意義：

　　臨床樣本沙眼衣原體抗原檢測(cè)陽(yáng)性可作為診斷生殖道沙眼衣原體感染的依據(jù)，但該方法的敏感性較低，陰性結(jié)果不排除患者感染沙眼衣原體。

　　二、直接免疫熒光法

　　1. 檢測(cè)原理：

　　熒光標(biāo)記的抗沙眼衣原體單克隆抗體與樣本中的沙眼衣原體結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光的衣原體原體或包涵體。

　　2. 檢測(cè)準(zhǔn)備：

• 　　儀器設(shè)備：熒光顯微鏡。
• 　　檢測(cè)試劑盒：包括熒光標(biāo)記抗沙眼衣原體單克隆抗體、已知沙眼衣原體陽(yáng)性和陰性對(duì)照片、磷酸鹽緩沖液、堿性甘油封片劑。

　　3. 樣本采集：

　　該方法檢測(cè)的適宜樣本一般為宮頸樣本和尿道樣本。

　　4. 檢測(cè)流程：

• 　　樣本片制備：將采集的拭子樣本，均勻的涂布在玻片上，自然干燥后，滴加丙酮固定10min。
• 　　樣本、陰性和陽(yáng)性對(duì)照片各滴加熒光標(biāo)記抗沙眼衣原體抗體。
• 　　放置于濕盒中，37℃孵育30min。
• 　　磷酸鹽緩沖液洗滌數(shù)次，每次10min，自然干燥。
• 　　滴加堿性甘油后加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
• 　　結(jié)果判讀：參照陰性、陽(yáng)性對(duì)照片結(jié)果，觀察試驗(yàn)樣本。40x10倍鏡下發(fā)現(xiàn)10個(gè)及以上單一針尖樣綠色熒光的顆粒，判為陽(yáng)性；每片可見(jiàn)小于10個(gè)單一針尖樣綠色熒光的顆粒，判為可疑；未發(fā)現(xiàn)典型發(fā)綠色熒光顆粒，僅可見(jiàn)復(fù)染紅棕色的細(xì)胞則為陰性。

　　5. 臨床意義：

　　臨床樣本沙眼衣原體抗原檢測(cè)陽(yáng)性可作為診斷生殖道沙眼衣原體感染的依據(jù)，但該方法的敏感性較低，陰性結(jié)果不排除患者感染沙眼衣原體。

　　6. 注意事項(xiàng)：

• 　　樣本采集后立刻制備樣本片，制備涂片時(shí)拭子輕輕滾動(dòng)且要涂布均勻。
• 　　使用的玻片應(yīng)清潔，防止雜質(zhì)引起的假陽(yáng)性染色。
• 　　涂片邊緣的濃集染色可能是由于熒光試劑干涸引起，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

　　直接免疫熒光法法適用于多種標(biāo)本，具有特異、快速的優(yōu)點(diǎn)，但由于判讀受主觀因素影響，且熒光標(biāo)記物不穩(wěn)定，不適宜標(biāo)本篩查。免疫層析法雖然敏感性較低，但因操作簡(jiǎn)單，省時(shí)快捷，對(duì)場(chǎng)地和設(shè)備要求低，目前在我國(guó)臨床上仍被廣泛應(yīng)用。

　　核酸檢測(cè)法

　　沙眼衣原體的核酸檢測(cè)方法主要有實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)及基于核酸的POCT等。核酸檢測(cè)主要通過(guò)擴(kuò)增沙眼衣原體的7.5kb隱蔽性質(zhì)粒DNA、染色體DNA或23S rRNA、16S rRNA等靶基因來(lái)檢測(cè)病原體。目前最成熟的技術(shù)還是熒光PCR法。

　　由于全球新冠疫情的大流行，目前我國(guó)人群已經(jīng)對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的流程比較熟悉了，臨床進(jìn)行沙眼衣原體的流程主要也是樣本采集—核酸提取—上機(jī)擴(kuò)增—結(jié)果判讀，具體操作細(xì)節(jié)會(huì)根據(jù)各個(gè)廠家不同試劑以及儀器而有所不同，因此這里不再贅述。

　　目前所有美國(guó)FDA批準(zhǔn)的商品化核酸擴(kuò)增檢測(cè)產(chǎn)品均可適用于男性尿液和尿道拭子，女性宮頸分泌物、陰道分泌物及尿液，國(guó)內(nèi)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)日前適用的樣本主要為男性尿道拭子和女性宮頸拭子，尚不能應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)性樣本（男性尿液、女性陰道拭子及女性尿液）的檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外所有的核酸檢測(cè)試劑目前對(duì)生殖道外的樣本如直腸和咽部拭子均未被批準(zhǔn)應(yīng)用，因此建議在生殖道外部位檢測(cè)出陽(yáng)性的樣本時(shí)，仍需要進(jìn)一步的試驗(yàn)排除假陽(yáng)性。

　　Nelson等對(duì)使用不同女性標(biāo)本進(jìn)行NAATs檢測(cè)的準(zhǔn)確性進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出陰道拭子( 臨床采集或自采) 以及宮頸拭子均優(yōu)于尿液檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度.見(jiàn)下圖：

　　對(duì)于男性人群，Chernesky等對(duì)男性尿道拭子和首段尿標(biāo)本用 NAATs 進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示無(wú)論有無(wú)癥狀，尿液即可達(dá)到檢測(cè)要求。 在主流的熒光PCR技術(shù)之外，基于核酸的POCT近年來(lái)也越來(lái)越受到關(guān)注?；诤怂岬腜OCT方法可在封閉系統(tǒng)中自動(dòng)進(jìn)行樣品制備、提取、擴(kuò)增和檢測(cè)，出具結(jié)果。目前也有一些品牌獲得不同國(guó)家的認(rèn)證，但是相關(guān)體系未來(lái)的普及性應(yīng)用需要繼續(xù)探索。

　　血清學(xué)檢測(cè)

　　血清學(xué)試驗(yàn)對(duì)泌尿生殖道沙眼衣原體檢測(cè)的敏感性和特異性不高，日前不推薦應(yīng)用于急性無(wú)并發(fā)癥的泌尿生殖道感染的診斷和篩查。在許多患者中，僅有侵入性沙眼衣原體才可以導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體水平達(dá)到可檢測(cè)的量，抗體水平可以保持許多年，且個(gè)體差異較大。近期，美國(guó)的研究團(tuán)隊(duì)正通過(guò)開(kāi)發(fā)多抗原表位聯(lián)合的檢測(cè)手段，來(lái)提高血清學(xué)抗體檢測(cè)的靈敏度和特異性。整體而言，新型血清學(xué)抗體檢測(cè)方法仍處于探索階段。

　　總結(jié)

　　鑒于50%男性和70%女性感染沙眼衣原體后表現(xiàn)為無(wú)狀感染，建議對(duì)育齡期女性、性病門(mén)診就診者、有高危性行為的人群等進(jìn)行篩查。核酸擴(kuò)增技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)以及高通量的優(yōu)點(diǎn)，可用于生殖道沙眼衣原體感染的篩查與檢測(cè) 。 

沙眼衣原體檢測(cè)試劑

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